L’équipe étudie les bases neurales des mécanismes neurophysiologiques et comportementaux chez la Drosophile. Nos approches, pluridisciplinaires, vont de la caractérisation des gènes (clonage) jusqu’à l’étude d’une fonction intégrée, l’activité locomotrice, et plus récemment, l’olfaction. Au niveau méthodologique, ceci implique la génétique et la biologie moléculaire, la neuro-anatomie, l’analyse comportementale, et l’imagerie cérébrale fonctionnelle, in-vivo, en bioluminescence. Nous avons développé un paradigme de vidéo-tracking permettant de quantifier précisément l’activité locomotrice et de décrire ces multiples paramètres. Plus récemment, nous avons développé une nouvelle technique d’imagerie cérébrale, in-vivo, en bioluminescence, basée sur une protéine chimérique (GFP-aequorin), permettant d’enregistrer l’activité neuronale. Trois axes thématiques sont développés en parallèle.

Thématique 1

Imagerie cérébrale fonctionnelle, in-vivo, en bioluminescence.
Ces dernières années, nous avons développé une nouvelle technique d’imagerie cérébrale, in-vivo, en bioluminescence, basée sur une protéine de fusion, GFP-aequorin (GA) L’aequorin est une protéine sensible au calcium, qui en présence de son cofacteur, la coelenterazine, émet de la lumière (bioluminescence). Nous avons généré des Drosophiles transgéniques P[UAS-GFP-aequorin], et cibler, avec le système binaire P[GAL4], ce traceur dans diverses parties du cerveau (Corps Pédonculés et complexe central). Ainsi, nous pouvons visualiser, in-vivo, en temps réel, et en continue, sur de longue période, l’activité neuronale.

a) Caractérisation de la réponse olfactive suite à des stimuli naturels (odeurs).
Ces dernières années, la caractérisation génétique et moléculaire des récepteurs olfactifs a permis une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes neurophysiologiques à la base du codage neuronal des odeurs. Néanmoins, la caractérisation de l’activité neuronale induite par une odeur, et par conséquent, le codage des odeurs reste encore largement incomprise. Nous avons enregistré l’activité neuronale induite par la présentation de stimuli naturels (odeurs) à différents niveaux des voies (circuit) olfactives (image) dans les neurones sensoriels olfactifs (ORNs) au niveau des lobes antennaires, puis dans les neurones de projections (PNs) et finalement dans les Corps Pédonculés (Mushroom-Bodies). Nous avons montré que l’application répétée d’une odeur induit un phénomène d’adaptation (habituation) au niveau des neurones sensoriels (ORNs). Cette adaptation est spécifique pour chaque odeur. A partir d’une approche génétique (RNAi), complémentée par une approche pharmacologique, nous avons montré que le blocage des récepteurs aux Inositol 1,4,5-triphosphate (InsP3R) ou à la ryanodine (RyR), bloque cette adaptation. Afin d’étudier les conséquences, pour la Drosophile, de la perturbation de l’adaptation, les mouches exprimant un RNAi (dirigé contre les InsP3R et/ou RyR) spécifiquement dans les neurones olfactifs (ORNs) montrent, dans le labyrinthe en T (image) des défauts importants dans leur comportement olfactif. En effet, bien que l’acuité olfactive ne soit pas affectée chez ces mouches, ces dernières sont incapables de discriminer entre l’odeur et l’air (control), contrairement aux mouches normales. C’est la première étude montrant que l’adaptation olfactive dépends du calcium du réticulum endoplasmique (Murmu et al.,).

b) Caractérisons de la réponse secondaire tardive au niveau des lobes des Corps Pédonculés, induites par l’application de nicotine.
Utilisant une approche pharmacologique, nous avons montré que l’application de nicotine (qui mime une afférence olfactive) engendre, comme attendue, une réponse primaire et transitoire au niveau des dendrites (calyx) des neurones des Corps Pédonculés, ainsi que dans les corps cellulaires et les lobes (projections/axones). Cependant, de façon inattendue, une deuxième réponse, retardée, apparaît environ 10 minutes plus tard dans les lobes uniquement. Cette réponse est autonome cellulaire puisqu’elle est bloquée par la thapsigargin, suggérant qu’il s’agit de Ca2+ en provenance du réticulum endoplasmique. De plus, elle est diminuée dans le mutant dunce, suggérant que la voie de signalisation de l’AMPc est impliquée dans la transmission (signalisation) intra-cellulaire de cette deuxième réponse, et par conséquent, qu’elle pourrait être cruciale dans les phénomènes d’apprentissage et de mémoire (Martin et al., 2007) (image). Nous projetons de poursuivre la caractérisation de cette réponse secondaire tardive. Quelle voie de signalisation est mise en jeu ? Nous allons rechercher, par diverses approches, tant génétique (mutations, RNAi) que pharmacologique, le rôle des récepteurs aux InsP3R et/ou à la ryanodine. Par une approche similaire, l’analyse de cette réponse, dans les divers mutants (dunce, rutabaga, amnesiac) permettra de d’élucider le rôle de la voie de l’AMPc dans ce processus. Finalement, afin de déterminer si cette réponse est impliquée dans l’apprentissage et la mémoire olfactive, nous envisageons (éventuellement en collaboration) de comparer des mouches naïves avec des mouches qui auront reçu un entraînement olfactif (mémoire à court terme et/ou à long terme).

c) Caractérisation de l’activité neuronale dans le corps ellipsoïdal, en relation avec l’activité locomotrice.
Nous avons aussi exprimé la GFP-aequorin (GA) dans le Complexe Central (CC), une structure impliquée dans le contrôle de l’activité locomotrice (Martin et al., 1999b, 2002). L’expression de la GA dans le corps ellipsoïdal (lignée P[GAL4]C232) a permis de détecter un signal calcique dans ces neurones (Martin et al., 2007) (image). C’est la première fois que des signaux physiologiques sont détectés dans cette structure, localisée profondément, en plein centre du cerveau. Ce résultat valide la sensibilité de cette approche, ce qui permettra, dorénavant, l’enregistrement de n’importe lesquels neurones du cerveau Nous avons également développé un appareillage (micro-balle soutenue par un jet d’air, dont la rotation est quantifiée de façon opto-électronique) permettant de quantifier l’activité locomotrice de la mouche. Ainsi l’enregistrement simultanément de l’activité cérébrale dans le corps ellipsoïdal (ou d’autres structures du cerveau) et de l’activité locomotrice seront corrélées.

d) Constructions de cartes anatomo-fonctionnelles (ATLAS fonctionnel) de l’activité général de l’ensemble du cerveau, via une expression pan-neuronal et/ou dans les cellules gliales.
Les caractéristiques particulières de cette nouvelle sonde calcique, qui ne requiert pas de stimulation lumineuse, et donc qui n’engendre pas d’autofluorescence, ni de photo-toxicité, ni de photo-atténuation (photo-bleaching), permet des enregistrements en continue sur de longue période.
Ainsi, suite à une expression dans tous les neurones du cerveau (expression pan-neuronal par la lignée P[elav-GAL4]), nous avons pu enregistrer, en continue, l’activité cérébrale spontanée, simultanément sur l’ensemble du cerveau, sur plusieurs heures (overnight) (image) et (video 1) . Cette expérience permet, pour la première fois, de démontrer et valider la faisabilité d’une cartographie anatomo-fonctionnelle globale du cerveau, en d’autres termes, de faire un ATLAS fonctionnel. Ainsi, on pourra effectuer un ATLAS fonctionnel en fonction du sexe (mâles versus femelles : dimorphisme sexuel), selon l’âge des mouches (jeunes versus âgées : effet du vieillissement), dans des fonds génétique mutants, ou encore sur des modèles Drosophiles de maladies neurodégénératives (modèle Drosophile d’Alzheimer, Huntington, Parkinson, etc.).
De façon similaire, nous avons aussi ciblé cette sonde dans les cellules gliales (repo-GAL4), et enregistré l’activité (spontanée) de ces cellules.(image) et (video 2)

Thématique 2

Etude du rôle du Complexe Central : caractérisation génétique et moléculaire de la lignée P[GAL4]4C, exprimée dans le corps ellipsoïdal et impliquée dans le pattern temporel de l’activité locomotrice.
Le profile temporel de l’activité locomotrice est hautement organisé et présente une structure de type fractal (Martin et al, 1999a ; 1999b, Martin, 2004). Cette organisation précise dépend du corps ellipsoïdal (Martin et al., 2002), puisque le blocage de la transmission synaptique (par l’expression dirigée d’une toxine) des neurones de cette structure, issue de certaines lignées P[GAL4], dont la lignée 4C, ont un profile temporel d’activité locomotrice de type aléatoire (plutôt qu’une distribution organisée de type fractal). Ce résultat suggère que dans la lignée 4C, l’insertion de l’élément-P perturbe (mute) un gène avoisinant (Martin et al., 2002). Pour quel produit code ce gène ? Quels neurotransmetteurs ou neuropeptides sont perturbés dans ces neurones pour engendrer un tel phénotype ?
La lignée 4C marque environ 20 à 30 neurones ayant une arborisation en anneau dans le corps ellipsoïdal.
La caractérisation génétique et moléculaire des gènes situés au voisinage de l’insertion de l’élément-P de la lignée 4C est en cours. En plus des défauts d’activité locomotrice, les mouches de la lignée 4C présentent des crises spastiques de type épileptiforme. Ces phénotypes sont en cours de caractérisation. Par conséquent, ce travail pourrait éventuellement conduire à mettre au point un nouveau modèle d’étude sur l’épilepsie.

Thématique 3

Caractérisation des structures cérébrales impliquées dans la centrophobie et la thigmotaxie (deux composantes de l’orientation spatiale).
La quantification précise de l’activité locomotrice (en video-tracking) (lien 3) nous a permis de révéler que les mouches évitent le centre de l’arène, un phénomène appelé centrophobie/thigmotaxie, deux composantes de l’orientation spatiale (Martin, 2004). Nous avons entrepris la recherche des structures cérébrales pouvant être impliquées dans ce comportement complexe et hautement intégré.
Succinctement, nous avons montré, par différentes approches : mutation, ablation chimique, toxigénétique, que les mouches dont les Corps Pédonculés (CPs) sont perturbés présentent une diminution de la centrophobie (Besson and Martin, 2005).
Dans un deuxième temps, comme les CPs ont été grandement investigués pour leur rôle dans l’apprentissage et la mémoire olfactive, nous avons étudié si les mutants connus pour perturber cette fonction montrent également des défauts d’orientation spatiale. Ainsi, les mutants affectant les CPs, dont plus précisément celles de la voie de l’AMPc (dunce, rutabaga, amnesiac et PKA), montrent aussi des défauts important dans l’orientation spatiale.
Nous avons également identifié un nouveau mutant, issue de la lignée P[GAL4]C316, présentant des défauts très importants de centrophobie et d’orientation spatiale. En effet, ces mouches présentent une distribution complètement aléatoire dans l’arène (Lebreton and Martin, 2009) (image).
Nous envisageons maintenant de caractériser au niveau génétique et moléculaire (cloner) ce nouveau gène.

Enseignements

1) Responsable d’un module de 2ième année de Maîtrise (M2). Université Paris-Saclay et Paris-Sud, Orsay (25 Heures). Modèles Vertébrés et Invertébrés de Pathologies humaines

2) La Drosophile, modèle de pathologies humaines. M2 Biologie du Développement, Spécialité « Endocrinologie », Université Paris-Sud (XI), Orsay. (2 Heures/an)

3) Unité d’enseignement de M1 : Neuroscience Intégrative (NSI) : Université Paris-Sud (XI). Neurophysiologie et Bases Neurales des Comportements chez la Drosophile (4 heures/an)

5) M1 : Biologie-Santé : Introduction aux Méthodes d’Imagerie (2 jours/an)

6) M1 : Biologie-Santé : Module Technologique de Neurosciences (2 jours/an)

Publications choisies

• Soulé S, Mellottée L, Arab A, Chen C, Martin JR. (2020). Jouvence a small nucleolar RNA required in the gut extends lifespan in Drosophila. Nat Commun 11, 987. DOI: 10.1038/s41467-020-14784-1
• Lark A, Kitamoto T, Martin JR. (2017). Modulation of neuronal activity in the Drosophila mushroom body by DopEcR, a unique dual receptor for ecdysone and dopamine. Biochim Biophys Acta, Mol. Cell Res., 1864, 1578-1588. DOI: 10.1016/j.bbamcr.2017.05.015
• Murmu MS, Martin, JR (2016). Interaction between cAMP and intracellular Ca2+-signaling pathways during odor-perception and adaptation in Drosophila. Biochim Biophys Acta, Mol. Cell Res., 1863, 2156-2174. DOI: 10.1016/j.bbamcr.2016.05.014
• Lark AR, Kitamoto T, Martin JR (2016). In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin. J Vis Exp., 107, doi: 10.3791/53705. DOI: 10.3791/53705
• Pierre Pavot, Elena Carbognin, Jean-René Martin (2015). PKA and cAMP/CNG Channels Independently Regulate the Cholinergic Ca2+-Response of Drosophila Mushroom Body Neurons. eNeuro, DOI: 10.1523/ENEURO.0054-14.2015
• Martin J.R, Rogers KL, Chagneau C, Brûlet P (2007) In vivo Bioluminescence Imaging of Ca2+ Signalling in the Brain of Drosophila. PLoS ONE 2(3): e275. DOI: 10.1371/journal.pone.0000275
• Martin, J.-R. (2004). A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Process., 67, 207-219. DOI: 10.1016/j.beproc.2004.04.003
• Martin, J.R., Faure, F., and Ernst, R. (2002). The Power Law Distribution for Walking-Time Intervals Correlates with the Ellipsoid Body in Drosophila. J. Neurogenetics, 15, 1-15. DOI: 10.3109/01677060109167377